眾所周知，癌癥是一類嚴(yán)重危害大眾健康的慢性病。2020年3月國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的《癌癥防治核心信息及知識(shí)要點(diǎn)》顯示，我國(guó)每年新發(fā)癌癥病例超過350萬，死亡病例超過200萬，防控形勢(shì)嚴(yán)峻。
癌癥是一類由基因突變以及轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和蛋白質(zhì)組學(xué)的變化引起的多基因疾病，這些變化可以作為早期篩查、診斷和個(gè)體化治療的重要生物標(biāo)志物。例如，幾種已知致癌基因（例如EGFR、HER2、KRAS）和腫瘤抑制基因（例如TP53、PTEN、PI3K）的突變已被用作生物標(biāo)志物，指導(dǎo)乳腺癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌等疾病的治療。
癌癥的早期篩查和早期治療對(duì)于提高患者的生存和生活質(zhì)量至關(guān)重要，一旦惡性腫瘤患者病情進(jìn)入中晚期，治愈率會(huì)大大降低。傳統(tǒng)的癌癥檢測(cè)方法如組織活檢等存在侵入性、操作繁瑣等情況，不利于推動(dòng)癌癥早篩工作。
于是，大家的目光轉(zhuǎn)向了液體活檢。
液體活檢是重要的癌癥早篩工具
已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞所釋放出的生物標(biāo)志物能進(jìn)入體液，研究人員可以從中提取腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵信息用于分析，由此液體活檢技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。相較于組織活檢，液體活檢的優(yōu)勢(shì)在于非介入性、可重復(fù)、操作方便、能及時(shí)反映腫瘤細(xì)胞發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)尚在早期的腫瘤，為腫瘤早篩提供了有效的途徑。
近幾年在全球范圍內(nèi)，癌癥早篩成為熱門的研究和應(yīng)用領(lǐng)域。下一代測(cè)序（NGS）的廣泛應(yīng)用顯著地促進(jìn)了血液、尿液、唾液、胸腔積液和腦脊液（即液體活檢）中癌癥生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。利用NGS對(duì)整個(gè)基因組或數(shù)千個(gè)突變同時(shí)進(jìn)行高效測(cè)序，可以作為生物標(biāo)志物檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)的有力工具。同時(shí)，在國(guó)內(nèi)也有眾多企業(yè)開始布局癌癥早篩領(lǐng)域，并進(jìn)行產(chǎn)品轉(zhuǎn)化。
液體活檢的腫瘤生物標(biāo)志物
液體活檢作為體外診斷的重要分支，通過捕獲和檢測(cè)血液、尿液、唾液、腹水、胸膜積液等液體活檢中的生物標(biāo)記物來診斷和監(jiān)測(cè)腫瘤等疾病。
液體活檢所檢測(cè)的腫瘤生物標(biāo)志物包括游離核酸（cfDNA/cfRNA）、細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell，CTC）等。
一、 游離核酸
游離核酸（cfDNA/cfRNA）是循環(huán)于體液中而游離于細(xì)胞外的核酸，主要是機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞程序性死亡后裂解所釋放出的DNA或者RNA。
cfDNA（cell free DNA）
cfDNA是液體活檢領(lǐng)域廣泛檢測(cè)的對(duì)象，尤其是游離在體液中的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。ctDNA來源于凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤的特征。外周血中的ctDNA包含了癌基因/抑癌基因的突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、后生遺傳學(xué)變異等基因變異信息，現(xiàn)階段主要通過高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)分析這些信息并應(yīng)用于臨床。
在腫瘤早期篩查研究領(lǐng)域，ctDNA一直是各大廠商、科研工作者關(guān)注的重點(diǎn)。
cfRNA（cell free RNA）
cfRNA，是存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中的一些內(nèi)源性或外源性微量RNA片段，包括mRNA、miRNA和lncRNA等。
科研人員發(fā)現(xiàn)，單純的ctDNA檢測(cè)不能全面反映疾病在RNA水平的生物活性，無法明確突變對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的影響。而RNA水平的檢測(cè)能明確癌癥在特定時(shí)間發(fā)生的變化，可定期監(jiān)控疾病的發(fā)展及對(duì)治療的反應(yīng)，并預(yù)測(cè)身患同一癌癥的不同個(gè)體將對(duì)不同療法有何反應(yīng)，因此受到廣泛關(guān)注。
二、 細(xì)胞外囊泡
細(xì)胞外囊泡（EV）是細(xì)胞在靜息或應(yīng)激狀態(tài)下釋放的各種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡總稱，主要由外泌體、微囊泡和凋亡小體組成，廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及血液、尿液等體液中，被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物。
三、 循環(huán)腫瘤細(xì)胞
循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC），是指從實(shí)體瘤中脫離出來并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，CTC數(shù)目往往很少。
目前對(duì)游離核酸（cfDNA、cfRNA）的應(yīng)用比較成熟。各大檢測(cè)服務(wù)提供商、科研工作者對(duì)游離核酸的關(guān)注一直十分強(qiáng)烈。不少液態(tài)活檢研究人員開始同時(shí)檢測(cè)cfDNA與cfRNA兩個(gè)水平的變化，聯(lián)合分析提供更全面的臨床數(shù)據(jù)。但是，在開發(fā)游離核酸檢測(cè)項(xiàng)目時(shí)，研發(fā)人員常面臨多種挑戰(zhàn)：
1. 游離核酸在外周血中含量較低。
2. 游離核酸穩(wěn)定性、完整性不足，存在一定程度降解。
3. 建庫(kù)流程較長(zhǎng)，操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)員素質(zhì)有更高要求。
對(duì)以上困難點(diǎn)，通常考慮從兩個(gè)方面進(jìn)行解決：當(dāng)核酸含量不足時(shí)，可以選擇一些更好的核酸提取技術(shù)，也可以選擇低起始量的文庫(kù)構(gòu)建方案；對(duì)于核酸品質(zhì)差，降解嚴(yán)重的樣本，可以選擇兼容低品質(zhì)核酸的文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)。綜合看來，選擇能支持微量核酸起始、兼容不同品質(zhì)核酸的文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)能夠一次解決上述所有問題。
Takara的可用于cfRNA、cfDNA的NGS解決方案，可以從容面對(duì)游離核酸項(xiàng)目研發(fā)遇到的各種瓶頸。
cfRNA文庫(kù)構(gòu)建
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（Pico v3）
Pico v3如何解決FFPE、cfRNA樣本降解，微量建庫(kù)的難題：
Pico v3支持250 pg-10 ng total RNA起始，即使珍貴的微量臨床樣本，也無需過于擔(dān)心樣本量不足。
支持RIN2-10或DV200≥25%的RNA起始，無論是品質(zhì)較好還是高度降解的cfRNA樣本，都能生成優(yōu)質(zhì)的文庫(kù)。
創(chuàng)新性地引入了ZapR Rprobes的核糖體去除技術(shù)，無需提前處理rRNA，便可在建庫(kù)過程中識(shí)別、切斷核糖體來源的cDNA，最終能在7.5h 內(nèi)完成鏈特異性Illumina文庫(kù)的構(gòu)建。
通過添加UMI，Pico v3可以靈敏地識(shí)別PCR重復(fù)片段并校正PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤，從而進(jìn)行正確的樣本數(shù)據(jù)回溯，提供更可靠的RNA-Seq分析。
實(shí)驗(yàn)案例
分別使用250 pg -10 ng 的人腦部總RNA制備文庫(kù)，每個(gè)起始量2個(gè)技術(shù)重復(fù)。從下表可以看出不同起始量的情況下，測(cè)序數(shù)據(jù)非常相似。TPM≥0.1的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量超過60,000，并且保留了鏈來源信息。讀段中比對(duì)到核糖體cDNA的比例在14%到18%之間，即以250 pg 和10 ng RNA 起始制備的文庫(kù)具有高度一致性。
以上數(shù)據(jù)結(jié)果也證明，微量cfRNA起始時(shí)， 使用Pico v3可以得到同樣高品質(zhì)的文庫(kù)。
cfDNA文庫(kù)構(gòu)建
雖然cfDNA的應(yīng)用日趨成熟，但總有一些微量樣本無法用傳統(tǒng)技術(shù)完成高品質(zhì)文庫(kù)的構(gòu)建，特別是在進(jìn)行腫瘤早期診斷有重要價(jià)值的稀有突變分析時(shí)。
ThruPLEX Tag-Seq HV Kit
ThruPLEX Tag-Seq HV試劑盒支持單管、三步操作，手動(dòng)15 min，全程2 h，過程中無需轉(zhuǎn)管與純化，實(shí)驗(yàn)小白也能輕松上手。
ThruPLEX Tag-Seq HV支持5-200 ng FFPE DNA、cfDNA起始，input volume為30 μl，無需樣品濃縮。
搭配UDI建庫(kù)，ThruPLEX Tag-Seq HV可以有效降低index hopping效應(yīng)，是高通量型Illumina測(cè)序儀的“友好伙伴”。
通過添加UMI，ThruPLEX Tag-Seq HV雙端總共可有144種UMI連接到DNA分子兩端，足以正確區(qū)分是測(cè)序錯(cuò)誤還是真實(shí)的稀有突變。
實(shí)驗(yàn)案例
Takara科學(xué)家采用ThruPLEX Tag-Seq HV 對(duì)10 ng 起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品（AccuRef）構(gòu)建文庫(kù)，該ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品帶有一系列特征化的不同頻率（0%，1%，5%）突變位點(diǎn)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，腫瘤相關(guān)的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel進(jìn)行捕獲富集。結(jié)果顯示，目標(biāo)區(qū)域的捕獲高效可靠，10 ng 起始的DNA樣本約有79%的reads來自或者接近目標(biāo)區(qū)域。
隨后，Takara科學(xué)家用UMIs鑒定了ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品中特定位點(diǎn)的實(shí)際突變頻率，結(jié)果顯示，檢測(cè)到的突變頻率分別與預(yù)期1%、5%的等位突變頻率接近，而陰性對(duì)照組沒有在位點(diǎn)處檢測(cè)到任何突變。
（數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.）
以上結(jié)果表明，ThruPLEX Tag-Seq HV文庫(kù)構(gòu)建系統(tǒng)，具有流程完整、快速，文庫(kù)復(fù)雜度高，結(jié)果可靠性高，兼容困難樣本等特點(diǎn)，適用于腫瘤學(xué)研究等應(yīng)用領(lǐng)域。
另外，Takara在今年對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了升級(jí)，推出了ThruPLEX Tag-Seq HV PLUS Kit：在ThruPLEX Tag-Seq HV的基礎(chǔ)上，整合了ThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Module的完整文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。不僅保留了ThruPLEX HV的顯著功能，并且無需在文庫(kù)制備之前進(jìn)行任何機(jī)械打斷或單獨(dú)的酶切片段化處理，從而實(shí)現(xiàn)了性能和速度的充分結(jié)合。
經(jīng)過上述的介紹，相信大家已經(jīng)對(duì)液體活檢的重要性以及游離核酸的建庫(kù)方案有了初步認(rèn)識(shí)，也對(duì)Takara兼容cfDNA/RNA的SMARTer、ThruPLEX技術(shù)有所了解。上述涵蓋微量核酸起始、兼容不同品質(zhì)核酸、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)的SMARTer、ThruPLEX技術(shù)或許能助力相關(guān)實(shí)驗(yàn)開展或項(xiàng)目研發(fā)。
文章來源：基因谷
